요 약

본 발명은 암세포의 운동성을 실시간으로 분석하여 암세포에 적합한 항암제를 보다 정확하고 짧은 시간 내에 찾 아낼 수 있는 항암제 반응성 검사 방법을 제공하기 위한 것으로 적어도 하나 이상의 투명한 배양 챔버 내에서 암 세포 시료를 배양하는 단계, 항암제의 종류 또는 농도 중 어느 하나 이상을 조작변수로 설정하여 상기 항암제를 상기 배양 챔버에 투여하는 단계 및 상기 배양 챔버 내의 암세포 위치 변화를 설정된 시간 동안 주기적으로 측정 하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명은 암세포에서 가장 적합한 항암제의 적정 농도 및 적정 시간 등을 세포의 운동성을 통하여 용이 하게 찾을 수 있고, 종래의 형광체 혹은 색소의 염색과정을 생략할 수 있는 이점이 있으며, 대량의 세포 검색 시 에도 빠르고 객관성 높게 판독 가능한 효과가 있다.

대 표 도

특허청구의 범위

▶ 청구항 1

(a)적어도 하나 이상의 투명한 배양 챔버 내에서 암세포 시료를 배양하는 단계;

(b)항암제의 종류 또는 농도 중 어느 하나 이상을 조작변수로 설정하여 상기 항암제를 상기 배양 챔버에 투여하 는 단계; 및

(c)상기 배양 챔버 내의 암세포 위치 변화를 설정된 시간 동안 주기적으로 측정하는 단계를 포함하고, 상기 (c)단계는
영상부의 이미지 획득수단에서 획득된 상기 암세포 시료의 이미지로부터 상기 암세포의 존재 여부와 상기 암세 포의 개체수를 인식하는 제1단계;
상기 암세포에 식별 인자 부여 수단을 이용하여 개체별 고유 식별 인자를 부여하는 제2단계;
세포 위치변화 측정수단을 이용하여 상기 암세포의 개체별 무게중심을 측정하는 제3단계; 및
상기 설정된 시간보다 경과 시간이 작을 경우 상기 제3단계를 재수행하며, 상기 설정된 시간보다 경과 시간이 클 경우 무게 중심 변화량을 출력하여 상기 암세포의 이동량을 측정하는 제4단계 를 포함하는 암세포의 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법.

▶ 청구항 2

(a')적어도 하나 이상의 투명한 배양 챔버 내에서 암세포 시료를 배양하는 단계;

(b')항암제의 종류 또는 농도 중 어느 하나 이상을 조작변수로 설정하여 상기 항암제를 상기 배양 챔버에 투여 하는 단계;

(c')상기 배양 챔버와 채널로 연결된 투명한 주화성 챔버에 주화성 촉진 물질을 투입하는 단계; 및

(d')상기 배양 챔버 내의 암세포 위치 변화를 설정된 시간 동안 주기적으로 측정하는 단계 상기 (d')단계는
영상부의 이미지 획득수단에서 획득된 상기 암세포 시료의 이미지로부터 상기 암세포의 존재 여부와 상기 암세 포의 개체수를 인식하는 제1단계;
상기 암세포에 식별 인자 부여 수단을 이용하여 개체별 고유 식별 인자를 부여하는 제2단계;
세포 위치변화 측정수단을 이용하여 상기 암세포의 개체별 무게중심을 측정하는 제3단계; 및
상기 설정된 시간보다 경과 시간이 작을 경우 상기 제3단계를 재수행하며, 상기 설정된 시간보다 경과 시간이 클 경우 무게 중심 변화량을 출력하여 상기 암세포의 이동량을 측정하는 제4단계 를 포함하는 암세포의 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법.

▶ 청구항 3

제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 암세포는 유방암 세포, 피부암 세포, 골암 세포, 전립선암 세포 , 간암 세포, 폐암 세포, 뇌암 세포, 후두 암 세포, 담낭암 세포, 췌장암 세포, 섬세포암, 직장암 세포, 부갑상선암 세포, 갑상선암 세포, 부신암 세포, 신경조직암 세포, 두경부암 세포, 결장암 세포, 위암 세포, 기관지암 세포, 신장암 세포로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 암세포의 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법.

▶ 청구항 4

삭제

▶ 청구항 5

제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제1단계는
상기 암세포 시료의 이미지를 세포인식부의 흑·백 반전수단을 이용하여 지정된 영역에 대한 이진화 영상처리를 수행함으로써 흑·백 반전하는 단계; 및
개체 인식 수단을 이용하여 상기 흑·백 반전된 경계면의 명암차이에 따라 암세포를 인식하는 단계
를 포함하는 암세포의 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법.

▶ 청구항 6

제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제4단계는,
상기 무게 중심의 변화량을 그래프로 출력하는 암세포의 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법.

▶ 청구항 7

제 6 항에 있어서,
상기 제4단계는,
최초 산출된 무게 중심 값을 상대좌표 원점으로 설정하여 출력하는 암세포의 운동성 분석을 이용한 항암제 반응 성 검사방법.

청구항 4

삭제

대 표 도

▶ 발명의 상세한 설명
발명의 목적
발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술

본 발명은 암세포의 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법에 관한 것으로서, 구체적으로 실시간으로 암 세포의 위치 변화를 측정하여 암세포의 운동성을 분석하고 이로 인하여 항암제에 대한 암세포의 반응성을 검사 하는 방법에 관한 것이다.

세포의 증식 또는 살아있는 세포를 정확하게 측정할 수 있는 기법은 생명과학 분야, 특히 종양 생물학에서 필수 적인 기법 중의 하나이다. 새로운 항암제 개발을 위한 표능 검색이나 기존에 개발된 항암제의 감수성을 알아보 기 위하여 동물실험 등 생체에의 적용 단계 이전에 생체 밖에서의 약물의 종양세포 성장 억제력을 알아보는 과 정을 거쳐야 한다.

가장 직접적이고 이상적인 방법은 세포에 독성이 없는 생체염료인 트리판 블루(trypan blue)등을 처리한 후 현 미경과 혈구 계산기(hemocytometer)를 이용하여 직접 살아있는 세포를 세는 것이지만 많은 시간과 노력이 요구 되므로 검체수가 많을 경우에는 사용할 수가 없기 때문에 세포의 살아있는 정도를 간접적으로 측정하려는 여러 가지 방법들이 개발되어 왔다.

항암제의 시험관(in vitro) 약효 검색법에는 집락형성 분석법(clonogenic assay)과 모든 암세포에 대한 세포독 성을 측정하는 단기적 항암제 감수성 검사법(short-term chemosensitivity test)이 있다. 집락형성 분석법은 클 론(clone)의 형성 정도를 이용하는 방법으로서 약물효능 검색에 많이 사용되었으나 단일 세포부유액의 준비가 어렵고, 세포의 종류에 따라 클론의 형성 정도가 다르기 때문에 실험자의 기준에 따라 결과가 달라질 수 있으며 결과를 얻기까지 많은 시간이 소요되는 등의 단점 때문에 1차 검색에는 적합하지 않다.

단기 검사법은 항암물질 처리 후 생존 암세포의 수를 대조군과 비교하는 것으로, 트리판 블루가 살아있는 세포 에는 염색되지 않는 점을 이용한 색소 배제법(dye exclusion assay), 살아있는 세포에서 환원된 형태의 51Cr이 산화된 형태로 변화되는 점을 이용하여 세포 용해시 유출되는 51Cr-표지된 단백질(51Cr-labeled protein)을 측 정하는 법 등이 종래에는 많이 사용되었으나 많은 시간과 노력이 필요하고 실험조작의 자동화가 곤란하여 대량 검색을 하기에는 적합하지 않다.

현재, 많이 사용되고 있는 MTT(Tetrazolium-based colorimetric) 검색법은 96-웰 플레이트(96-well plate)를 사용하고 검사결과를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 리더(reader)를 이용하여 많은 시료를 간단히 빠르고 객관성 높게 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 sulforhodamin B (SRB) 검색법과 더불 어 널리 사용되고 있다. MTT 검색법의 과정 중 생성된 formazan의 용해 단계를 생략한 방법으로서 MTT의 변형 물질인 XTT, MTS 등을 이용한 방법이 개발되어 사용되고 있으나 MTT 검색법에 비하여 백 그라운드(background) 가 높고 비용이 고가인 단점이 있다.

또한, MTT 검색법, XTT 검색법 및 MTS 검색법은 모두 세포의 실시간 관찰이 불가능하여 사멸 데이터만을 획득할 수 있는 문제점이 있으며, 여전히 대량 샘플의 분석에 한계가 존재한다.

▶ 발명이 이루고자 하는 기술적 과제

따라서, 본 발명은 상기의 종래 기술을 해결하기 위한 것으로 암세포의 위치 변화에 따른 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법을 제공함에 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 암세포의 운동성을 실시간으로 분석하여 암세포에 적합한 항암제를 보다 정확하고, 짧은 시간 내에 찾아낼 수 있는 항암제 반응성 검사 방법을 제공함에 다른 목적이 있다.

▶ 발명의 구성 및 작용

본 발명에 일실시예에 따른 암세포 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법은 적어도 하나 이상의 투명한 배양 챔버 내에서 암세포 시료를 배양하는 단계, 항암제의 종류 또는 농도 중 어느 하나 이상을 조작변수로 설 정하여 상기 항암제를 상기 배양 챔버에 투여하는 단계 및 상기 배양 챔버 내의 암세포 위치 변화를 설정된 시 간 동안 주기적으로 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 암세포 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법은 적어도 하나 이상의 투 명한 배양 챔버 내에서 암세포 시료를 배양하는 단계, 항암제의 종류 또는 농도 중 어느 하나 이상을 조작변수 로 설정하여 상기 항암제를 상기 배양 챔버에 투여하는 단계, 상기 배양 챔버와 채널로 연결된 투명한 주화성 챔버에 주화성 촉진 물질을 투입하는 단계 및 상기 배양 챔버 내의 암세포 위치 변화를 설정된 시간 동안 주기 적으로 측정하는 단계를 포함한다.

이때, 상기 암세포는 유방암 세포, 피부암 세포, 골암 세포, 전립선암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 뇌암 세포, 후두암 세포, 담낭암 세포, 췌장암 세포, 섬세포암, 직장암 세포, 부갑상선암 세포, 갑상선암 세포, 부신암 세 포, 신경조직암 세포, 두경부암 세포, 결장암 세포, 위암 세포, 기관지암 세포, 신장암 세포로 구성된 군으로부 터 선택될 수 있다.

그리고, 배양 챔버 내의 암세포 위치 변화를 설정된 시간 동안 주기적으로 측정하는 단계는 상기 암세포 시료의 이미지로부터 암세포의 존재 여부와 상기 암세포의 개체수를 인식하는 제1단계, 상기 암세포의 개체별 고유 식 별 인자를 부여하는 제2단계, 상기 암세포의 개체별 무게중심을 측정하는 제3단계 및 상기 설정된 시간보다 경 과 시간이 작을 경우 상기 제3단계를 재수행하며, 상기 설정된 시간보다 경과 시간이 클 경우 무게 중심 변화량 을 출력하는 제4단계를 포함한다.

이때, 상기 제1단계는 상기 암세포 시료의 이미지를 흑·백 반전하는 단계; 및 상기 흑·백 반전된 경계면의 명 암에 따른 암세포 인식 단계를 포함하며, 상기 제4단계는 무게 중심의 변화량을 그래프로 출력하되, 최초 산출 된 무게 중심 값을 상대좌표 원점으로 설정하여 출력하도록 한다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서 는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면이 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이 고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양 한 균등물과 변형예들이 있을 수 이해하여야 한다.

도 1은 본 발명에서 사용된 세포 관찰 시스템의 구성도이다. 도 1에 도시된 바와 같이 세포 관찰 시스템은 세포 의 이미지를 획득하기 위한 영상부(110), 세포 이미지로부터 세포를 인식하기 위한 세포 인식부(120), 상기 세 포 인식부를 제어하기 위한 제어부(130), 세포 인식부로부터 인식된 세포의 물리적 특성을 측정하기 위한 측정 부(140), 측정된 결과값의 변화량을 다양한 방법을 통하여 출력하는 출력부(150), 측정부로부터 측정된 물리적 특성 및 그에 따른 결과값과 세포의 이미지 및 기 설정값 등을 저장하기 위한 저장부(160) 및 출력된 물리적 특 성값, 세포의 이미지등을 화면상으로 표시하기 위한 표시부(170)로 구성된다.

이 중, 영상부(110)는 세포의 영상 이미지를 획득하기 위한 이미지 획득 수단 및 세포의 이미지를 원하는 형태 로 편집하기 위한 세포 이미지 편집수단을 포함한다. 이때, 세포는 투명한 재질의 챔버 혹은 웰 플레이트 내에 서 배양되어, 챔버 혹은 웰 플레이트를 개봉되지 않은 상태에서 배양되고 있는 세포의 이미지를 획득할 수 있도 록 한다.

이미지 획득 수단은 일반적으로 세포 이미지를 관찰할 수 있는 수단으로서, 직접조명을 사용한 위상차 현미경을 적용하거나, 간접조명 및 반사판을 사용한 CCD 카메라 또는 세포 관찰용 현미경을 적용할 수 있다. 세포 이미지 는 이와 같은 현미경을 사용하여 용이하게 획득 가능하고 이때, 세포 이미지는 한장의 사진형태 혹은 동영상 형 태로 얻을 수 있다.

그리고, 이미지 편집 수단은 획득된 세포의 이미지를 사용자로 하여금 관찰하기 용이하도록 하기 위하여 세포의 이미지를 확대, 축소, 이동, 회전, 조명 및 배경 설정의 변경 등을 수행한다.

세포 인식부(120)는 획득된 세포의 이미지로부터 세포의 개체를 인식하기 위한 것으로서, 흑·백 반전 수단, 개 체 인식 수단, 식별 인자 부여 수단을 포함한다. 세포 인식부(120)의 흑·백 반전 수단은 획득된 세포의 이미지 를 흑백 영상으로 처리하여 이진화 처리를 가능하게 하며, 개체 인식 수단은 흑백 영상으로부터 세포와 배경(세 포 외의 영역인 배양액)과의 경계면에서 발생하는 명암차이를 통하여 세포 개체를 인식한다. 이때, 인식된 세포 의 개체가 복수일 경우, 식별 인자 부여 수단은 각각의 세포 개체에 고유한 식별 인자, 예를 들어 고유 번호 혹 은 명칭 등을 부여하여 복수의 세포가 존재하더라도 동시에 각 개체별 세포의 이력을 용이하게 관찰할 수 있도 록 한다.

제어부(130)는 세포 인식부를 제어하기 위한 것으로 인식영역 제어수단 및 개체지정 제어수단을 포함한다. 이때, 인식영역 제어수단은 세포의 이미지로부터 세포 개체를 명확하게 인식하기 위한 것으로서, 세포의 인식이 제대로 이루어지지 않을 경우, 세포 인식영역을 재설정함으로써 세포를 명확하게 인식할 수 있으며, 개체지정 제어수단은 복수의 개체가 존재할 경우, 특정한 개체만을 지정하여 물리적 특성등의 세포 이력을 관리할 수 있 도록 하기 위한 것으로서, 관찰자로하여금 특정 세포의 이력 관리를 자동으로 수행할 수 있도록 한다. 측정부(140)는 세포 인식부(120)를 통하여 인식된 하나 혹은 복수의 세포 개체들의 물리적 특성 및 변화량을 측 정한다. 대표적인 물리적 특성 및 변화량은 세포의 이동 경로를 나타내는 세포 위치변화로서, 위치 변화 측정수 단이 이러한 기능을 수행한다.

측정부(140)의 위치 변화 측정수단은 우선적으로 세포의 무게 중심을 측정하고, 이렇게 측정된 무게 중심이 일 정한 시간에 따라 변화된 값을 통하여 세포의 이동량을 측정한다. 이때, 측정된 무게 중심 값은 좌표값으로 산 출되어 이후, 세포의 이동량의 측정 시 좌표의 변화량을 통하여 용이하게 그 이동량을 측정할 수 있으며, 위치 변화 측정수단을 통하여 측정된 결과값을 이용하여 부가적으로 세포의 이동 속도, 가속도 등을 측정할 수도 있 다.

면적변화 측정수단은 세포를 다각형의 도형으로 인식하여 그 면적을 측정한 후, 일정한 시간에 따라 변화된 값 을 통하여 세포의 면적변화를 측정한다. 개체수 변화 측정수단 또한 일정한 시간에 따라 세포의 개체 변화량의 측정을 통하여 전체적인 세포 개체수의 변화량을 측정할 수 있다. 측정부(140)는 상기의 측정수단 외에도 기타 세포의 물리적 특성을 측정하기 위한 측정 수단을 필요에 따라서 부가적으로 적용할 수도 있다.

출력부(150)는 측정부(140)를 이용하여 측정된 세포의 물리적 특성값을 여러가지 수단을 이용하여 출력한다. 출 력부는 그래프 출력수단, 데이타 테이블(Data table) 출력수단, 도형 출력수단 및 음향 출력수단으로 구성된다.

그래프 출력수단은 세포의 물리적 특성값, 더욱 상세하게는 세포의 물리적 특성의 변화를 그래프화하여 사용자 로 하여금 세포의 이력을 관찰하기 용이하도록 하며, 데이타 테이블 출력수단은 세포의 물리적 특성값 혹은 변 화값을 데이타 테이블화하여 출력하며, 도형 출력수단은 사용자의 요구에 맞게 세포의 물리적 특성 혹은 변화값 들을 도형화하여 세포의 변화량 관찰을 용이하게 한다. 또한 상황에 따라서, 음향 출력수단을 이용하여 측정값 혹은 변화값을 음향등으로 출력할 수도 있다.

그리고, 표시부(160)를 통하여 세포의 이미지, 세포의 물리적 특성 측정값 혹은 변화값과 더불어 출력부를 통하 여 다양한 형태로 출력된 결과값들을 사용자가 관찰하기 용이하도록 화면상으로 디스플레이한다.

저장부(170)는 설정값 저장수단, 이미지 저장수단, 측정값 저장수단 및 출력값 저장수단 등을 구비하여 세포 이 력의 자동 관찰을 위하여 사용자가 설정한 측정시간 혹은 측정 위치 등의 기 설정값, 영상부로부터 획득된 이미 지, 측정부로부터 획득된 세포의 물리적 특성 측정값 및 변화값, 출력부에서 출력된 결과값 등의 정보를 저장한 다.

이때, 이미지 저장수단은 영상부로부터 획득된 세포의 이미지를 이미지 파일 형식으로 저장한다.

이하, 상술한 세포 관찰 시스템을 사용하여 암세포의 특정 약제(drug)에 대한 세포 독성을 관찰과 더불어 운동 성을 관찰함으로써 암세포에 적합한 약제를 찾아내는 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.

[일실시예] 항암제에 대한 암세포의 반응성 분석

본 발명의 일실시예는 상술한 세포 관찰 시스템을 이용하여 항암제에 대한 암세포의 반응성을 분석하기 위한 것 으로 더욱 상세하게는 간암세포 또는 폐암세포에 적합한 약제를 찾아내기 위하여 간암세포 또는 페암세포의 특 정 약제에 대한 세포 독성 관찰과 더불어 운동성을 관찰하도록 한다.

이를 위하여, 우선 간암세포주인 HepG2와 폐암세포주인 NCL-H23 세포를 각각 투명한 96 웰 플레이트(96 well plate, 5000cell/well)에 파종(播種, seeding)한 후, 약 37℃의 온도에서 24시간 동안 배양한다.

이후, 각각의 96 웰 플레이트에 다양한 항암제(anti-cancer drug)를 투여하여 다양한 조건으로 관찰한다.

본 발명의 일실시예에서는 하기의 표 1에 도시된 바와 같은 항암제 Daunorubicin, Dexamethasone, Doxorubican, Etoposide, Docetaxel를 96 웰 플레이트에 분류별로 투입하고, 이때 각 항암제의 농도는 각각 100uM(micro mol), 30uM, 10uM, 3uM, 0.3uM, 0.1uM, 0.03uM으로 구분하여 투입한다. 그리고, 항암제를 투여한 후 24시간, 48시간, 72시간 동안 배양하는 과정에 있어, 간암세포 또는 폐암세포의 특정 약제에 대한 세포 독성 및 세포 운동성을 관찰한다.

▶ 표1

이때, 간암세포 또는 폐암 세포의 특정 약제에 대한 세포 독성 및 세포 운동성은 상술한 바와 같은 세포 관찰 시스템을 사용한다.

세포 관찰 시스템의 영상부는 상기 웰 플레이트에 존재하는 간암세포 또는 폐암 세포의 이미지를 획득한다.

이때, 암세포의 이미지는 본 출원인이 기 출원한 특허출원 제2006-0106142호에 개시된 바와 같은 간접조명과 반 사판 그리고 일반 현미경을 이용하여 획득하거나, 직접조명 및 위상차 현미경을 이용하여 획득하여도 무방하다.

이후, 사용자가 관찰하고자하는 임의의 영역 즉, 96 웰 플레이트에 존재하는 간암세포 및 폐암세포를 지정하면, 세포 인식부에서는 흑·백 반전 수단을 이용하여 지정된 영역에 대한 이진화 영상 처리를 수행한다.

이진화 영상 처리를 통하여 암세포와 배양액이 흑·백으로 반전되어 표시되며, 일예로 암세포는 흑색으로 배양 액은 백색으로 표시된다. 따라서, 세포 인식부에서는 암세포와 배양액의 경계면에서 발생하는 명암차이를 통하 여 암세포의 존재 여부를 판별할 수 있으며 암세포가 존재하는 영역 즉, 각 암세포 개체별 인식과정을 수행한다.

이때, 복수의 개체수를 가지는 간암세포 및 폐암세포 각각에 고유한 식별 인자를 부여한다. 즉, 간암세포 및 폐 암세포의 개수와 동일한 개수의 고유 식별번호(①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥)를 부여한다.

이후, 각각의 임세포별 물리적 특성 값(세포의 운동성)을 측정하도록 한다.

본 발명의 일실시예에서는 암세포의 운동성 즉, 이동량을 측정하기 위하여 세포 위치변화 측정수단을 이용한 각 암세포의 무게 중심값을 산출한다.

암세포의 무게 중심 값은 x, y 좌표값(x, y)으로 산출된다. 즉, 고유 식별번호를 가지는 암세포별 무게중심 값 을 산출하는 것으로 무게중심의 측정시 시간을 같이 산출하도록 할 수 있다.

이후 일정한 시간간격 즉 설정된 시간과 경과 시간을 비교하여 각 시간별 암세포의 무게 중심 값을 상술한 방법 을 이용하여 주기적으로 산출하여 좌표값의 변화에 따라 각각의 암세포 이동량을 측정한다. 이때, 측정 시간 간 격 및 종료시간(설정된 시간)의 설정은 사용자에 따라 다양하게 변경될 수 있다.

이와 같이 각 암세포의 개체수별로 일정한 시간 간격을 통하여 측정된 무게중심값은 출력부를 통하여 그래프화 할 수 있으며, 이로 인하여 암세포 개체의 위치 변화를 측정할 수 있다.

이때, 암세포의 이동거리는 암세포가 처음으로 관찰되어 처음으로 측정된 무게 중심값과 암세포가 마지막으로 관찰되어 마지막으로 측정된 무게 중심값 간의 차를 통하여 구할 수 있으며, 암세포의 이동 속도는 암세포의 이 동 시간에 따른 암세포의 이동 거리를 통하여 용이하게 산출할 수 있으며, 처음으로 측정된 무게 중심값을 상대 좌표 원점으로 하여 이동 방향 및 속도 혹은 가속도를 측정한다.

이와 같은 방법으로 암세포의 운동량 즉, 이동량 변화를 자동으로 용이하게 측정할 수 있는 것이다.

그리고, 측정에 사용된 간암세포주와 폐암세포주의 사멸 여부의 측정은 소정의 시간 동안 세포의 이동변화가 없 을 경우 이를 사멸한 것으로 가정하여, [소정의 시간 동안 이동량이 0인 암세포의 개수/암세포의 총 개수]×100 을 통하여 사멸률을 용이하게 측정할 수 있다.

이후, 출력된 결과를 사용자가 관찰하기 용이하도록 하나의 표시부 상에 이미지 형태로 표시할 수 있으며, 이때, 출력된 결과값 및 세포의 이미지는 저장부에 저장함으로써 세포의 이력 데이터의 관리를 용이하게 수행할 수도 있다.

따라서, 간암세포주 및 폐암세포주와 같은 암세포에서 가장 적합한 항암제의 적정 농도 및 적정 시간을 세포의 운동성을 통하여 용이하게 찾을 수 있고, 종래의 형광체 혹은 색소의 염색과정을 생략할 수 있는 이점이 있으며, 대량의 세포 검색 시에도 빠르고 객관성 높게 판독가능한 이점이 있다.

[다른 실시예] 항암제 투여와 관련한 암세포의 주화성 분석

이하, 상술한 일실시예와 같은 암세포의 특정 약제에 대한 세포의 운동성 관찰을 이용하여 암세포의 주화성을 측정하는 방법을 설명하면 다음과 같다.

우선, 항암제를 투여하지 않은 대조군을 형성한다.

항암제를 투여하지 않은 대조군은 음성 대조군(negative control), 양성 대조군(positive control)으로 구분된 다.

양성 대조군의 형성은, 도 2에 도시된 바와 같이 주화성 측정 장치(300)의 투명한 제1챔버(310)에 유선암 세포 MDA-MB-231(KCB No. 33026)을 0.1%의 우태혈청(fetal bovine serum, 이하 'FBS'라 한다)을 함유하는 동물세포 배양용 배지(DMEM)에 푼 것 중 100㎕(세포 5000함유)를 파종한 후, 약 37℃의 온도, 5%의 CO2 농도, 및 75%의 습도를 유지하여 약 1시간 동안 배양한다.

그리고, 상기 제1챔버(310)의 반대측에 구비된 투명한 제2챔버(320)에 0.1%의 FBS를 함유하는 DMEM내에 EGF 50ng/㎖을 넣어 제1챔버로부터 제2챔버(320)까지 연결되는 투명한 채널(330)에 0 내지 50ng/㎖의 농도 구배를 형성한다.

이후, 상술한 일실시예와 동일한 방법으로 실시간 세포의 이동거리를 관찰하고,측정한다.

이때, 실시간 세포의 이동거리 측정 시간 간격은 2분 단위로 설정하여 약 24시간 동안 측정한다.

한편, 음성 대조군의 형성은 주화성 측정을 위한 제1챔버에 유선암 세포 MDA-MB-231(KCB No. 33026)을 0.1%의 우태혈청(fetal bovine serum, 이하 'FBS'라 한다)을 함유하는 동물세포배양용 배지(DMEM)에 푼 것 중 100㎕ (세포 5000함유)를 파종한 후, 약 37℃의 온도, 5%의 CO2 농도, 및 75%의 습도를 유지하여 약 1시간 동안 배양 하고, 제1챔버의 반대측에 구비된 제2챔버에 주화성 촉진 물질을 촉진하지 않는 0.1%의 FBS를 함유하는 DMEM만 을 넣어 상술한 일실시예와 동일한 방법으로 실시간 세포의 이동거리를 관찰하고 측정한다.

이때, 실시간 세포의 이동거리 측정 시간 간격 또한 2분 단위로 설정하여 24시간 동안 측정한다.

그리고, 상술한 바와 같이 항암제를 투여하지 않은 음성 대조군(negative control) 및 양성 대조군(positive control)의 측정 결과들은 항암제를 투여한 실험군들과 비교하여 암세포의 주화성 분석 시 음성 대조군 (negative control)으로서의 역할을 수행한다. 즉, 암세포의 이동(migration)을 활성화시켜 각종 항암제의 세포 이동의 억제(inhibition) 정도를 비교, 측정할 수 있는 기준으로 이용하는 것이다.

항암제를 투여한 실험군은 주화성 측정을 위한 제1챔버에 유선암 세포 MDA-MB-231(KCB No. 33026)을 0.1%의 우 태혈청(fetal bovine serum, 이하 'FBS'라 한다)을 함유하는 동물세포배양용 배지(DMEM)에 푼 것 중 100㎕(세 포 5000함유)를 파종한 후, 약 37℃의 온도, 5%의 CO2 농도, 및 75%의 습도를 유지하여 약 1시간 동안 배양한다.

그리고, 상기 제1챔버에 항암제를 투여한다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 항암제는 암세포가 존재하는 제1챔버에 암세포의 이동을 약 50% 저해하기 위 하여 필요한 농도(IC50) 및 부피로 투여한다.

이때, 다양한 종류의 항암제에 따른 효과를 알아보기 위하여 실험군을 다수개로 형성할 경우, 다양한 종류의 항 암제를 상술한 조건에 맞추어 투여할 수 있다.

이후, 상기 제1챔버의 반대측에 구비된 제2챔버에 0.1%의 FBS를 함유하는 DMEM내에 EGF 50ng/㎖을 넣어 제1챔버 로부터 제2챔버까지 연결되는 채널에 0 내지 50ng/㎖의 농도 구배를 형성한다.

그리고, 상술한 일실시예와 동일한 방법으로 실시간 암세포의 이동거리를 관찰하고,측정한다.

이때, 실시간 세포의 이동거리 측정 시간 간격은 2분 단위로 설정하여 약 24시간 동안 측정한다.

한편, 항암제를 투여하여 음성 대조군을 추가로 형성하여 암세포의 이동거리를 관찰하고 측정한다.

항암제를 투여한 음성 대조군은 상술한 실험군과 동일한 조건으로 형성하되, 제2챔버에 주화성 촉진 물질을 첨 가하지 않는다.

본 발명의 다른 실시예에서 상술한 바와 같이, 각 항암제의 억제 정도를 용이하게 비교 분석할 수 있으므로, 암세포에 가장 효율적인 항암제를 용이하게 찾을 수 있으며, 항암제에 의한 암세포의 이동 정도와 형태 (morphology) 변화를 실시간으로 확인하여 각 항암제가 암세포에 미치는 영향에 대하여 보다 정확한 분석을 가 능하게 한다.

또한, 새로운 항암제 물질을 개발할 경우 상술한 일실시예 또는 다른 실시예를 통하여 측정된 결과와 비교해 봄 으로써 항암제로써의 효용성을 세포 배양 챔버 또는 세포배양용 웰 상에서 쉽게 확인할 수 있다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시예에 한정되 지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가 진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

▶ 발명의 효과

본 발명에 따른 암세포의 운동성 분석을 이용한 항암제 반응성 검사방법은 암세포에서 가장 적합한 항암제의 적 정 농도 및 적정 시간 등을 세포의 운동성(세포의 위치변화)을 통하여 용이하게 찾을 수 있고, 종래의 형광체 혹은 색소의 염색과정을 생략할 수 있는 이점이 있으며, 대량의 세포 검색 시에도 빠르고 객관성 높게 판독가능 한 효과가 있다.

또한, 본 발명은 항암제에 의한 암세포의 이동 정도와 형태(morphology) 변화를 실시간으로 확인하여 항암제가 암세포에 미치는 영향에 대하여 보다 정확한 분석을 가능하게 하는 효과가 있다.

▶ 도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명에 따른 세포 관찰 시스템의 구성도.

도 2는 본 발명에 따른 주화성 측정 장치의 사시도.

<<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>>

300: 주화성 측정 장치

310: 제1챔버

320: 제2챔버

330: 채널

▶ 도면1

▶ 도면2